Unsere Partnerfirma GeneTex unterstützt Forscher mit einer umfassenden Auswahl an Tipps zur Fehlerbehebung für viele Probleme, die bei einem Western Blot (WB) Experiment auftreten können Laden Sie auch den Western Blot Troubleshhoting Guide von GeneTex als pdf herunter. Achten Sie darauf, die richtigen Positiv- und Negativkontrollen zu laden, um sicherzustellen, dass das WB-Verfahren korrekt durchgeführt wird.   Q1:Kein Signal Q2: Multiple oder extra Banden Q3: Hoher Hintergrund Q4: Schmiermuster Q5: Weiße Banden auf schwarzen Blots Q6: Schwarze Punkte Q7: Verzogene Banden Q8: Irreguläre weiße Verfärbungen auf dem Blot     Q1: Kein Signal   Mögliche Gründe: 1) Unzureichende Proteinmenge a. Unzureichende Zelllyse Stellen Sie sicher, dass die Zelllyse und die Proteinextraktion ordnungsgemäß erfolgen. b. Proteinabbau Geben Sie dem Lysepuffer vor der Zelllyse immer Proteaseinhibitoren zu und führen Sie die Proteinextraktion auf Eis durch, um Proteinabbau zu vermeiden. c. Geringe Expression des interessierenden Proteins Erhöhen Sie die Menge des auf das Gel geladenen Proteinextrakts, um dieses Problem zu lösen. Wenn das interessierende Protein gewebe- oder zelltypspezifisch exprimiert wird, stellen Sie sicher, dass Sie diesen spezifischen Gewebe- oder Zelltyp für Ihre Experimente auswählen. d. Das Protein von Interesse ist in einer bestimmten Organelle angereichert. Eine biochemische Fraktionierung subzellulärer Kompartimente kann notwendig sein, um diese Art von Protein nachzuweisen. e. Die Expression des interessierenden Proteins wird nur unter bestimmten Bedingungen induziert. Überprüfen Sie die einschlägige Literatur, um festzustellen, ob eine Behandlung (z. B. Hungern oder chemische Mittel) erforderlich ist, um eine angemessene Proteinexpression zu induzieren.   2) Unzureichender Transfer des Proteins vom Gel zur Membran a. Unvollständiger Transfer Stellen Sie sicher, dass die PVDF-Membran während des Transfers nass bleibt. PVDF-Membranen müssen vor dem Transfer durch Einwirkung von Methanol "aktiviert" werden. Ziehen Sie vor dem Experiment die Gebrauchsanweisung für die PVDF-Membran zu Rate. Die reversible Ponceau S-Membranfärbung ist ein einfacher Schritt zur Bestätigung des Proteintransfers. b. Über-Transfer Bitte passen Sie die elektrische Spannung und den Zeitrahmen für den Transfer an. Die Bedingungen sollten in Abhängigkeit vom Molekulargewicht des Zielproteins optimiert werden. Beachten Sie, dass Proteine mit hohem Molekulargewicht eine längere Zeit für den Transfer benötigen können.   3) Antikörper-Hybridisierung und Waschvorgang a. Unzureichender primärer oder sekundärer Antikörper  Verwenden Sie die empfohlenen Antikörperverdünnungen, die auf dem Produktdatenblatt beschrieben sind, als Ausgangspunkt für Ihr Experiment. Bei schwach exprimierten Proteinen kann es notwendig sein, die Konzentration des Antikörpers zu erhöhen. Vermeiden Sie die Wiederverwendung von primären Antikörpern, wann immer dies möglich ist. b. Unzureichende Inkubationszeit mit dem primären Antikörper Eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur ist normalerweise für den Nachweis der meisten Proteine ausreichend. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die Inkubationszeit zu verlängern (z. B. Inkubation über Nacht bei 4 °C). c. Falscher Sekundärantikörper Vergewissern Sie sich, dass der richtige Sekundärantikörper verwendet wird. Wählen Sie einen sekundären Antikörper, der gegen die spezifische Wirtsspezies und den Immunglobulintyp des primären Antikörpers gerichtet ist (d. h. ein primärer Antikörper, der in Kaninchen mit Isotyp IgG gezüchtet wurde, erfordert einen sekundären Antikörper gegen Kaninchen IgG). Alle Informationen zu Wirtsspezies und Isotyp finden Sie auf dem Datenblatt des primären Antikörpers. d. Übermäßiges Waschen der Membran Drei Waschvorgänge von jeweils 5~10 Minuten sind in den meisten Fällen ausreichend, um die unspezifische Bindung auszuwaschen. Vermeiden Sie übermäßiges Waschen der Membran, da dies die Menge des an das Zielantigen gebundenen primären Antikörpers verringern kann.   4) Schlechte Aktivität der ECL-Detektionsreagenzien. Stellen Sie sicher, dass die ECL-Reagenzien nicht abgelaufen sind. ECL-Reagenz verliert mit der Zeit an Aktivität, daher bereiten Sie das Reagenz immer unmittelbar vor der Detektionsreaktion vor.   5) Natriumazid-Interferenz. Natriumazid (NaN3) ist ein Inhibitor von HRP und kann die HRP-Aktivität unterdrücken. Stellen Sie sicher, dass sich kein Natriumazid im Antikörper-Verdünnungspuffer befindet und waschen Sie die Membran vor der Nachweisreaktion gründlich.   Nach oben   Q2: Multiple oder extra Banden   Mögliche Gründe:   1) Posttranslationale Modifikationen am Protein von Interesse Die posttranslationale(n) Modifikation(en) können zu mehreren Banden führen. Das modifizierte Protein erscheint normalerweise als Bande(n) oberhalb des vorhergesagten Molekulargewichts. Schauen Sie in der Literatur nach, ob es bekannte Modifikationen des Zielproteins gibt.   2) Proteinabbau Der Proteinabbau führt ebenfalls zu Mehrfachbanden. Das degradierte Protein wird in der Regel als mehrere Banden unterhalb des vorhergesagten Molekulargewichts gesehen. Stellen Sie sicher, dass dem Proteinextraktionspuffer Proteaseinhibitoren zugesetzt wurden. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen des Zelllysats.   3) Protein-Multimerisierung Kochen Sie die Proben ordnungsgemäß aus, um eine angemessene Denaturierung der Proteine zu gewährleisten. Denken Sie daran, dass frisch zugegebenes Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (2-ME) im Probenpuffer für die Reduktion von Disulfidbindungen erforderlich ist.   4) Alternative Spleißformen oder neuartige Proteine, die ähnliche Epitope aufweisen. Schlagen Sie in der Literatur nach und suchen Sie mit BLAST nach dem gewünschten Protein. Laden Sie eine empfohlene Positivkontrolle.   5) Die Konzentration des primären Antikörpers ist zu hoch Verringern Sie die Konzentration des primären Antikörpers oder reduzieren Sie die Inkubationszeit.   6) Die Konzentration des sekundären Antikörpers ist zu hoch Verringern Sie die Konzentration des sekundären Antikörpers. Inkubieren Sie nur mit einem sekundären Antikörper (ohne primären Antikörper) als Kontrolle.   7) Unspezifische Bindung Erhöhen Sie die Dauer des Waschens oder erhöhen Sie die Konzentration der Detergenzien im Waschpuffer.   Nach oben   Q3: Hoher Hintergrund   Mögliche Gründe:   1) Die Konzentration des primären oder sekundären Antikörpers ist zu hoch. Passen Sie die Konzentration des primären oder sekundären Antikörpers an.   2) Überbelichtung Verringern Sie die Belichtungszeit der Membran.   3) Unzureichende Blockierung Erhöhen Sie die Inkubationszeit mit Blocking-Puffer und stellen Sie sicher, dass ein geeigneter Blocking-Puffer verwendet wird.   4) Unzureichendes Waschen Erhöhen Sie die Dauer des Waschens oder erhöhen Sie die Konzentration der Detergenzien im Waschpuffer.   5) Im Blockierungspuffer vorhandene Antigene können mit primären oder sekundären Antikörpern kreuzreagieren Ändern Sie den Blockierungspuffer (z. B. von fettfreier Milch zu 3%~5% BSA oder verwenden Sie einen proteinfreien Blockierungspuffer)   6) Die Membran ist während der Inkubation ausgetrocknet Halten Sie die PVDF-Membran während der Inkubation feucht.   7) Ungeeignete Membran verwendet Wählen Sie den geeigneten Membrantyp für Ihr Experiment (z. B. ist die PVDF-Membran empfindlicher als die Nitrocellulose-Membran).   Nach oben   Q4: Schmiermuster   Mögliche Gründe:   1) Überladung der Proteinprobe Verringern Sie die Menge des auf das Gel geladenen Proteins.   2) Schlechte Gelvorbereitung Vergewissern Sie sich, dass die SDS-PAGE-Gelmischung richtig vorbereitet ist und dass das gegossene Gel vollständig polymerisiert. Überprüfen Sie bei Gelen, die bei 4°C gelagert wurden, dass sie nicht ausgetrocknet sind.   Nach oben   Q5: Weiße Banden auf schwarzen Blots   Mögliche Gründe:   1) Die Konzentration des primären oder sekundären Antikörpers ist zu hoch. Reduzieren Sie die Konzentration des primären und/oder sekundären Antikörpers.   2) Die Konzentration des Zielproteins ist zu hoch Verringern Sie die Menge des gereinigten Proteins oder des Zelllysats, das auf das Gel geladen wird.   Nach oben   Q6: Schwarze Punkte   Mögliche Gründe:   1) Reagenzien sind verunreinigt Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien ordnungsgemäß gelagert werden. Wenn möglich, bereiten Sie vor jedem Experiment frische Reagenzien vor.   2) Die Antikörper binden an ungelöstes Blocking-Reagenz Vergewissern Sie sich, dass das Blocking-Reagenz (z. B. fettfreies Milchpulver) vollständig aufgelöst ist. Filtern Sie ggf. das Blocking-Reagenz.   Nach oben   Q7: Verzogene Banden   Mögliche Gründe:   1) Schlechte Gelvorbereitung Vergewissern Sie sich, dass die SDS-PAGE-Gelmischung richtig vorbereitet ist und dass das gegossene Gel vollständig polymerisiert. Prüfen Sie bei Gelen, die bei 4 °C gelagert wurden, dass sie nicht ausgetrocknet sind.   2) Die Gel-Laufgeschwindigkeit ist zu schnell Verlangsamen Sie die SDS-PAGE-Gel-Laufgeschwindigkeit, indem Sie die Spannung reduzieren.   3) Die Gel-Lauftemperatur ist zu hoch Das "Lächeln" der migrierenden Proteine kann durch zu hohe Lauftemperaturen verursacht werden. Um dies zu verhindern, lassen Sie das Gel mit einer niedrigeren Spannung laufen oder kühlen Sie das Gel, indem Sie es in einem kalten Raum oder auf Eis laufen lassen.   4) Luftblasen, die während des Transfers im Spalt zwischen Membran und Gel eingeschlossen sind. Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen vor dem Transfer entfernt werden.   5) Die Membran wurde nicht vollständig vom Antikörper bedeckt. Vergewissern Sie sich, dass die Membran während der Inkubation mit einem ausreichenden Volumen an Reagenzien bedeckt ist.   Nach oben   Q8: Irreguläre weiße Verfärbungen auf dem Blot   Mögliche Gründe:   1) Luftblasen, die während des Transfers im Spalt zwischen Membran und Gel eingeschlossen sind. Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen vor dem Transfer entfernt werden.   2) Die Membran wurde nicht vollständig vom Antikörper bedeckt. Vergewissern Sie sich, dass die Membran während der Inkubation mit einem ausreichenden Volumen an Reagenzien bedeckt ist.   Nach oben  

Nach ein paar intensiven Tagen mit akribischen Gewebe-Waschschritten und Antikörper-Inkubationen ist meine Färbung endlich fertig. Ich starre sie unter dem Mikroskop an. Ich freue mich über das, was ich sehe: eine dunkelbraune Farbe genau dort, wo ich sie zu sehen erwarte! Bin ich gut oder was? Ich klopfe mir bildlich auf die Schulter und gebe mir ein imaginäres High Five. Aufgeregt und stolz rufe ich meinen Vorgesetzten an, der das Ergebnis aufmerksam betrachtet und mich dann mit Nachdruck und ziemlich überraschend auffordert, die Färbung zu wiederholen. Was ist falsch gelaufen? Was habe ich übersehen? Ich muss der Sache auf den Grund gehen! Die Immunhistochemie (IHC) ist ein gängiges Verfahren in der wissenschaftlichen Forschung und ein wertvolles Hilfsmittel in der Pathologie für die morphologische Diagnose und zur Untersuchung der Pathogenese von Krankheiten. Die korrekte Methodik und Interpretation eines immunhistochemischen Assays ist absolut entscheidend. Neben der Suche nach einem spezifischen Antikörper besteht eine große Herausforderung bei der IHC darin, unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren, ohne gleichzeitig die Antikörper-Epitop-Bindung zu beeinträchtigen. Um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen, sind jedoch mehrfache Bemühungen und ein tiefes wissenschaftliches Wissen über die Technik, das Gewebe und das Zielprotein erforderlich. Eine gute immunhistochemische Färbung wird erreicht, wenn eine ausreichende Menge des primären Antikörpers in die Probe eindringt, um das entsprechende antigene Ziel mit hoher Spezifität zu binden. In den meisten Fällen tragen jedoch dieselben physiochemischen Kräfte, die für spezifische Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen verantwortlich sind, wie z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen und Wasserstoffbindung, auch zu unspezifischen Bindungen und anderen Artefakten bei.   Es gibt nichts Trügerischeres als eine offensichtliche Tatsache Zu den üblichen Artefakten bei der IHC gehören unspezifische Bindung, hoher Hintergrund, Überfärbung oder zu schwache Färbung. Eine schwache Färbung kann als eine Färbung von mäßiger Intensität definiert werden, die in nicht mehr als 10 % oder weniger der Zellen vorhanden ist. Overstaining (auch High Background) liegt vor, wenn die Hintergrundfärbung so hoch ist, dass sie wichtige Merkmale und Strukturen des Gewebes verdeckt. Unspezifische Bindung bezieht sich auf die Bindung des Antikörpers, entweder des primären oder des sekundären Antikörpers, an etwas anderes im Gewebe als das vorgesehene Ziel, wie z. B. andere Proteine oder andere Epitope im Zielprotein.   Einen Verbrecher fangen: Wie löse ich meinen Fall?  Ich liebe und bewundere die kompromisslose detektivische Arbeit des Sammelns von Hinweisen, die immer im Mittelpunkt einer kriminalistischen Untersuchung steht. Die Tatortuntersuchung ist der Treffpunkt von Wissenschaft, Logik und strengen Protokollen. Beobachten, Befunde aufzeichnen, Verdächtige befragen, Fakten und Beweise zu Verdächtigen sammeln. Und man könnte behaupten, dass die Identifizierung der Fehlerquelle bei IHC-Färbungen eine identische Übung ist. Es ist die Aufgabe des Detektivs, alle physischen Beweise zu untersuchen und den Tatort zu sichern und zu untersuchen. Die Bearbeitung eines Tatorts ist ein langwieriger, mühsamer Prozess, der eine detaillierte Dokumentation der Bedingungen am Tatort und das Sammeln aller physischen Beweise beinhaltet, die möglicherweise dazu beitragen können, aufzudecken, was passiert ist, warum es passiert ist und ohne den Schatten eines Zweifels auf den Schuldigen zu zeigen.  Wenden Sie den gleichen Ansatz bei Ihrer IHC-Fehlersuche an.   Ich schaue mir meine IHC-Färbung an: Was sehe ich? Bei jeder Untersuchung sind die Details der Ereignisse, die von Zeugen geliefert werden, ein entscheidendes Element der gesammelten Beweise. Bei einem Immunhistochemie-Experiment wird die genaue Analyse der Färbeergebnisse Erkenntnisse aus verschiedenen Perspektiven liefern, aber diese Perspektiven müssen sorgfältig bewertet werden, um die Zuverlässigkeit der gelieferten Beweise, die Ursache und die erforderliche Lösung zu ermitteln.   Es ist nicht so schwer: Es dreht sich meist um drei Verdächtige. Ein Immunhistochemie-Experiment ist eine Kombination aus drei Hauptelementen: Probe, Applikation und experimentelles Protokoll. Eine exzellente IHC-Färbung wird erreicht, wenn alle erforderlichen Elemente, Qualitäten und Eigenschaften perfekt aufeinander abgestimmt sind. Eine Kombination, die so gut ist, wie es nur möglich ist. Wenn Sie also nach Verdächtigen suchen, die für das Artefakt in Ihrem IHC-Experiment verantwortlich sind, sollten Sie die 3 üblichen Verdächtigen im Auge behalten: Probe (Gewebe oder Zelle) Antikörper (primär und sekundär) IHC-Protokoll Schauen Sie sich die folgende Tabelle genau an: Diese Tipps werden Ihnen helfen, den möglichen Übeltäter zu identifizieren.        Beweis: Fehlende Färbung  Beweis: Hoher Hintergrund Beweis: Unspezifische Bindung Verdächtiger: Probe Probe exprimiert das Antigen nicht. Vorhandensein von Fc-Rezeptoren, die die Fc-Region von Antikörpern binden.  Schnitte sind zu dick und verhindern das Eindringen von Antikörpern. Probe ist beschädigt oder nekrotisch.  Probe ist eingetrocknet. Probe ist unzureichend fixiert oder überfixiert.     Probe ist eingetrocknet.    Verdächtiger: Antikörper Der primäre Antikörper funktioniert nicht in Ihrer Anwendung. Unspezifische Bindung zwischen dem Fc-Teil des Antikörpers und endogenen Fc-Rezeptoren. Der primäre Antikörper kann das Zielprotein nicht in nativer Konformation detektieren (kein Problem bei IHC mit FFPE).   Antikörper nicht ausreichend verdünnt.  Unsachgemäße Lagerung von Antikörpern.    Inkompatible Antikörper.    Verdächtiger: IHC-Protokoll Fehlende oder ungeeignete Antigenerkennung. Reagenzienunverträglichkeit oder unzureichendes Waschen. Überschüssiger Waschpuffer. Ungeeignetes Fixiermittel, verlängerte Fixierzeit und Intervall vor der Fixierung. Überschüssige Blocking-Lösung. Unzureichende Spüldauer. Endogene Enzymaktivitäten werden nicht blockiert. Unzureichender chromogener Nachweis. Ungeeignete Erkennungsmethode. Falsche Temperatur oder falscher pH-Wert bei der Antigengewinnung.   Verlängerte Zeit der Chromogenapplikation.     Leseempfehlungen   Buchwalow I. et al. Sci Rep. (2011) 1: 28, Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. De Matos L.L., et al. Biomarker Insights (2010):5 9–20, Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and clinical practice. Ramos-Vara J.A. and Miller M. A. Veterinary Pathology (2014) 51(1) 42-87, When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Ward J.M. and Rehg J.E. Veterinary Pathology, (2013) 51 (1) 88-101, Rodent Immunohistochemistry: Pitfalls and Troubleshooting.   Geschrieben von Dr. Laura Pozzi Dr. Laura Pozzi ist eine wissenschaftliche Autorin bei Atlas Antibodies. Sie hat einen Doktortitel in Life and Biomolecular Science von der Open University of London in Zusammenarbeit mit dem Mario Negri Institut für pharmakologische Forschung in Mailand. Laura hat als Forscherin am Karolinska Institutet in Schweden und in jüngerer Zeit als assoziierte Redakteurin gearbeitet. Sie kann auf eine lange Reihe wissenschaftlicher Publikationen als Erst- und Koautorin zurückblicken. Ihr Forschungsschwerpunkt liegt im Bereich der Neurowissenschaften mit einer breiten Erfahrung in der Validierung von Antikörpern und immunhistochemischen Techniken.

Plasmamembran (PM)-Proteine spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse. Signaltransduktion, molekularer Transport und Zell-Zell-Interaktionen werden alle durch PM-Proteine vermittelt. PM-Proteine umfassen eine Vielzahl wichtiger Proteine wie Neurotransmitter-Rezeptoren, G-Proteine, Carrier, spannungsabhängige Ionenkanäle, CD-Antigene und viele Zielproteine für Medikamente. Der Nachweis, die Charakterisierung und der intrazelluläre Transport von PM-Proteinen sind daher für das Verständnis biologischer Systeme unerlässlich.  Die Isolierung/Reinigung ist normalerweise der erste Schritt zur Charakterisierung und Profilierung von PM-Proteinen.  Es hat sich jedoch gezeigt, dass dies aufgrund ihrer geringen Abundanz und der Art der Interkonnektivität der intrazellulären Membransysteme eine besondere Herausforderung darstellt. PM-Proteine werden traditionell durch Saccharosedichte-Ultrazentrifugation isoliert [1,2].  Das Protokoll ist mühsam und zeitaufwendig und dauert Stunden bis sogar Tage.  In den letzten Jahren wurden in immer mehr Publikationen kommerzielle Kits für die Isolierung und Charakterisierung von PM-Proteinen zitiert, da sie einfach zu bedienen und schnell sind. Verschiedene Kits beschäftigen jedoch unterschiedliche Wirkmechanismen. Die Wirksamkeit des Kits variiert erheblich in Abhängigkeit von den spezifischen Downstream-Anwendungen. Aufgrund der Verfügbarkeit einer Vielzahl von PM-Protein-Isolierungs-/Reinigungskits auf dem Markt ist es manchmal schwierig oder sogar verwirrend, ein geeignetes Kit für ein bestimmtes Forschungsprojekt auszuwählen. In diesem Zusammenhang versuchen wir, die Vor- und Nachteile einiger häufig verwendeter Membranprotein-Isolierungskits zusammenzufassen und einen allgemeinen Leitfaden für die Auswahl kommerzieller Membranprotein-Isolierungskits bereitzustellen.   Generell lassen sich alle kommerziell erhältlichen Kits zur Isolierung von Membranproteinen nach ihren Wirkmechanismen bzw. Isolierungsprinzipien in vier grundlegende Kategorien einteilen. Phasen-Extraktion.  Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit (Thermo Fisher), Mem-PER® Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit (Thermo Fisher) und ProteoExtract™ Native Membrane Protein Extraction Kit (Millipore-Sigma) sind typische Kits, die zu dieser Klasse gehören. Zellen/Gewebe werden zunächst mit Lysispuffer lysiert, lösliche Proteine und unlösliche Fraktionen werden durch Zentrifugation getrennt. Die Membranproteine werden anschließend mit einem Extraktionspuffer, der auf der Hydrophobizität der Membranproteine basiert, aus der unlöslichen Fraktion extrahiert. Diese Kits sind relativ einfach und schnell (ca. 1h). Das Protokoll erzeugt zwei unterschiedliche Fraktionen: die zytosolische Fraktion und die Membranproteinfraktion, jedoch geht aus dem Protokoll nicht hervor, ob ein Detergens für die Zelllyse verwendet wird. Die extrahierten Membranproteine stammen aus allen Membransystemen wie Mitochondrien, ER, Golgi und Zellkernen. Was mit diesen Kits extrahiert wird, sind eigentlich totale Membranproteine. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Membranproteinextraktion für bestimmte Proben vollständig oder unvollständig sein kann, insbesondere für solche Proteine, die die Biomembran mehrfach durchqueren. Es ist nicht klar, ob membranassoziierte Proteine in den extrahierten Membranproteinen gebunden und intakt bleiben. Markierung der Zelloberfläche. Das Pierce-Kit zur Isolierung von Zelloberflächenproteinen (Thermo Fisher) und das Qproteomic Plasma-Membran-Kit (Qiagen) gehören zu dieser Klasse. Ein typisches Experiment mit dem Pierce Zelloberflächenprotein-Isolierungskit beinhaltet die Markierung von Zelloberflächenproteinen mit Sulfo-NHS-Biotin. Nach der Markierung werden die Zellen lysiert und das Zelllysat wird auf eine Avidin-konjugierte Festphase aufgetragen. Biotinylierte Plasmamembranproteine werden mit einem denaturierenden Elutionspuffer eluiert. Theoretisch sollte dieser Ansatz hoch gereinigte Plasmamembranproteine produzieren. In der Realität leidet diese Methode jedoch unter vielen ererbten Nachteilen. Zum Beispiel wird nicht jedes Protein auf der Zelloberfläche markiert werden. Das Proteinprofil einer gegebenen Zellkultur kann sich mit der Kulturzeit und den Kulturbedingungen ändern. Sterische Hinderungsgründe und fehlende primäre Amine können die Proteinmarkierung beeinträchtigen, was zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Die Verwendung von denaturierter Elutionslösung schränkt die Anwendung von isolierten Proteinen ebenfalls ein. Phasenaufteilung. Ein typisches Beispiel für diese Klasse ist das Plasma Membrane Protein Extraction Kit von Biovision und Abcam. Der Wirkmechanismus ähnelt einer früher veröffentlichten wässrigen Zwei-Phasen-Partitionierungsmethode [3].  Das Protokoll nutzt den Vorteil der differentiellen Partitionierung der Plasmamembran in der oberen Phase und anderer Membranen (wie ER, Golgi und Mitochondrien) in der unteren Phase zur Anreicherung und Isolierung von Plasmamembranproteinen. Kultivierte Zellen/Gewebeproben werden zunächst mit einem Dounce-Homogenisierer homogenisiert. Die lysierten Proben werden einer mehrfachen Extraktion und Zentrifugation unterzogen, wodurch Gesamtmembranprotein, zytosolische und Plasmamembranproteinfraktionen erhalten werden. Die Vorteile der Methode bestehen darin, dass sie Detergenz-freie Plasmamembranproteine isolieren kann und das Protokoll relativ probenschonend und schnell ist (ca. 1 -1,5 h). Allerdings werden große Zellzahlen benötigt (50-100 Millionen/Probe) und die Ausbeute ist relativ gering (1-100ug/Probe).  Der Hersteller behauptet, dass die Reinheit des Plasmamembranproteins über 90 % liegt, aber es werden keine unterstützenden Daten gezeigt. Zentrifugen-Säulen-basierte subzelluläre Fraktionierung.  Dies ist eine Technologie der nächsten Generation zur Isolierung von Plasmamembranproteinen von Invent Biotechnologies, die eine einfache und schnelle Methode zur subzellulären Fraktionierung ohne Verwendung eines Dounce-Homogenisators bietet. Zellen/Gewebe werden durch eine spezielle Filterkartusche geleitet. Die Plasmamembranen der Zellen werden während des Prozesses aufgerissen und intakte Kerne, Organellen, Plasmamembran und zytosolische Proteine werden in eine Suspension freigesetzt, die weiter in fünf Fraktionen getrennt wird: Gesamtmembran-, Plasmamembran-, zytosolische, organellare und Kernfraktion. Durch die Verwendung der Filterkartusche und eines einzigartigen Puffersystems kann eine hohe Ausbeute an nativem Plasmamembranprotein in weniger als einer Stunde mit minimalen Kreuzkontaminationen gewonnen werden. Das isolierte native Plasmamembranprotein kann für beliebige Downstream-Experimente verwendet werden. Im Gegensatz zu allen anderen oben beschriebenen Kits kann das Spin-Säulen-basierte Plasmamembran-Isolierungskit auch für die Isolierung von Pflanzen-PM-Protein verwendet werden. Dieses Kit erfreut sich immer größerer Beliebtheit, wie die Daten ausgewählter Publikationen unten zeigen. Die Auswahl eines bestimmten Membranprotein-Isolierungskits hängt hauptsächlich von den spezifischen Downstream-Anwendungen ab. Einige PM-Isolierungskits haben viel breitere Anwendungen als andere. Detergensfreie native PM-Proteine können z. B. für fast alle möglichen Downstream-Anwendungen verwendet werden, während die mit dem Pierce Zelloberflächenprotein-Isolierungskit isolierten Proteine nur für Western Blotting empfohlen werden. Die folgenden Beispiele veranschaulichen, was von einem guten subzellulären Fraktionierungskit erwartet wird. Viele PM-Proteine sind in relativ geringer Konzentration vorhanden. Manchmal ist es schwierig, Membranproteine ohne Isolierung und Anreicherung nachzuweisen und zu quantifizieren. Die folgenden Daten [4] zeigen deutlich den Effekt der PM-Protein-Anreicherung auf die Nachweisbarkeit von SGLT1 aus menschlichen Herzproben. Die Signale von SGLT und dem Plasmamembran-Markerprotein Na+/K+ ATPase sind in der Plasmamembranfraktion im Vergleich zur Gesamtmembranfraktion deutlich erhöht.   Kutluay et al. [5] untersuchten die Veränderungen der Gag-RNA-Bindung an virale RNA während der HIV-1-Virion-Assemblierung. Eines der wichtigsten Experimente ist der Nachweis unterschiedlicher Formen von Gag-RNA-Addukten, die an verschiedenen subzellulären Orten vorliegen. 4SU-gefütterte 293T-Zellen wurden mit dem proviralen HIV-1-Plasmid transfiziert und mit einem Spin-Säulen-basierten Plasma-Membran-Protein-Isolationskit fraktioniert. Die zytosolischen und Plasmamembran-Fraktionen wurden einem Western Blotting und einer Immunpräzipitation unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, dass das zytosolische Gag-Protein hauptsächlich monomer ist, während das Gag-Protein auf der Plasmamembran multimerisiert ist (B). Diese Schlussfolgerung hängt stark von der klaren Trennung der zytosolischen und der Plasmamembranfraktionen ab (A). Wenn eine signifikante Kreuzkontamination vorhanden ist, wäre die Schlussfolgerung fragwürdig.     Untersuchungen der intrazellulären Zielproteinverteilung und des Zielprotein-Traffics unter verschiedenen Versuchsbedingungen und unterschiedlicher Behandlung von Versuchsgruppen sind für die biomedizinische Forschung wichtig. Das Zielprotein kann durch subzelluläre Fraktionierung gefolgt von einer spezifischen Nachweismethode verfolgt werden. Leung et al. [6] untersuchten den Effekt von PRL-3 auf den ULBP2-Protein-Trafficking durch Zellfraktionierung. Die humane Kolonkarzinom-Zelllinie HCT 116 wurde mit 40 um RPL-3 behandelt und einer subzellulären Fraktionierung mit einem Spin-Säulen-basierten Plasmamembran-Isolationskit unterzogen. Die Ergebnisse zeigten eine klare Trennung von PM-, Organellen- und zytosolischen Fraktionen. Die Behandlung der Zelle mit der Chemikalie führt zu einer Translokation der Plasmamembran in die Organellenfraktion. Auch diese Schlussfolgerung basiert auf der klaren Trennung der unterschiedlichen subzellulären Fraktionen. Wie von Jose et al. [7] gezeigt, kann das Spin-column PM-Isolationskit (IBT-SM-005, Invent Biotechnologies) kultivierte Endothelzellen in verschiedene subzelluläre Fraktionen fraktionieren und, was am wichtigsten ist, das isolierte PM-Protein zeigt minimale/keine Kreuzkontamination mit Organellen wie Mitochondrien, ER und Golgi. Der Grad der Kreuzkontamination ist offensichtlich einer der wichtigsten Faktoren für die Auswahl eines Kits zur Membranproteinisolierung. Die Leistung kommerzieller Kits unterscheidet sich bei diesem Kriterium erheblich. Bunger et al. [8] verglichen fünf kommerzielle Kits zur Isolierung von Membranproteinen auf Kreuzkontaminationen zwischen zytosolischen (Cyt) und Plasmamembran (Mem) Fraktionen und fanden heraus, dass alle getesteten Kits eine offensichtliche Kreuzkontamination für zwei häufig verwendete Marker (ATPase und GAPDH) aufweisen. Die Leistung der Kits variiert erheblich, wenn Cadherin als PM-Marker verwendet wird. Es wird dringend empfohlen, bei der Auswahl eines Kits zur Isolierung von Membranproteinen auf Publikationen mit hohem Impact-Faktor zurückzugreifen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kits zur Isolierung von Membranproteinen wertvolle Werkzeuge für Forscher sind. Im Vergleich zu traditionellen Methoden kann ein guter kommerzieller Kit Zeit sparen. die Effizienz erhöhen und den Entdeckungsprozess beschleunigen.  Die Auswahl eines bestimmten Kits sollte hauptsächlich auf der Leistung und den spezifischen Downstream-Experimenten beruhen. Die erforderliche Probengröße ist manchmal ein wichtiger Faktor, der berücksichtigt werden muss, insbesondere wenn die verfügbare Zellzahl ein limitierender Faktor ist. Unter idealen Bedingungen sollte ein guter kommerzieller Kit dem Forscher die erwarteten Ergebnisse ohne nennenswerte Fehlersuche und Optimierung liefern. Ein weiteres zu berücksichtigendes Kriterium ist die Frage, ob das Kit dem Forscher einen Wettbewerbsvorteil in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Leistung und Kosten verschaffen kann.   Referenzen: Neville, D. M, (1960) The isolation of a cell membrane fraction from rat liver.  J. Biophy. Biochem. Cyto. 8: 413-421. Touster, O. et al. (1970) Isolation of liver plasma membranes.  J. Cell Bio. 47:604-618. Yoshida, S. et al. (1983) Partitioning of membrane particles in aqueous two-polymer phase system and its practical use for purification of plasma membranes from plants.Plant physiol. 72:105-114. Kashiwagi Y. et al. (2015) Expression of SGLT1 in Human Hearts and Impairment of Cardiac Glucose Uptake by Phlorizin during Ischemia- Reperfusion Injury in Mice. PLoS ONE 10(6):e0130605. Kutluay, S., et al. (2014). Global Changes in the RNA Binding Specificity of HIV-1 Gag Regulate Virion Genesis, Cell (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.057 Leung W-H. et al. (2015). PRL-3 Mediates the protein Maturation of ULBP2 by regulating the tyrosine phosphorylation of HSP60.The Journal of Immunology.doi:10.4049/jimmunol.1400817. Vazquez-Medina J.P. et al. (2016).  The phospholipase A2 activity of peroxiredoxin 6 modulates NADPH oxidase 2 activation vialysophosphatidic acid receptor signaling in the pulmonary endothelium and alveolar macrophages. The FASEB Journal. doi: 10.1096/fj.201500146R Bunger, S. et al. (2009) Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.  Cytotechnology. 61:153-159.    

Die SPHERO™-Kalibrierungspartikel sind vielseitig, stabil, wirtschaftlich und bequem in der Anwendung. Diese Partikel enthalten eine Mischung von Fluorochromen, die spektral vielen der in der Durchflusszytometrie verwendeten Fluorochrome ähnlich sind. Daher werden sie für den Routineabgleich, die tägliche Leistungsüberprüfung und die langfristige Leistungsverfolgung mehrerer Kanäle von Durchflusszytometern in einem Lauf verwendet. Die Partikel sind sehr stabil, da die Fluorochrome im Inneren der Partikel eingeschlossen sind, anstatt sich auf der Oberfläche zu befinden. Sie sind in einer praktischen Tropfflasche verpackt, um das Dispensieren und die Lagerung zu erleichtern. Die verdünnten Partikel können für eine spätere Verwendung aufbewahrt werden, falls dies gewünscht wird, um Kosten zu sparen. Diese Produkte und ihre Anwendungen werden im Folgenden kurz beschrieben:   Rainbow Kalibrierungspartikel: Regenbogen-Kalibrierungspartikel (Rainbow Calibration Particles, RCP) sind für die Routinekalibrierung der meisten verfügbaren Kanäle in jedem Durchflusszytometer vorgesehen. Diese Partikel werden z. B. zur Überprüfung des Geräte-Setups und zur Überprüfung der Linearität und Empfindlichkeit des Geräts verwendet. Wenn die werkseitig empfohlenen Verfahren für das Instrumenten-Setup verwendet werden, empfehlen wir, die RCP in QC-Programme einzubeziehen, um die langfristige und tägliche Leistung zu überprüfen.   UltraRainbow Kalibrierungspartikel: Neue Durchflusszytometer stellen eine zunehmende Anzahl von Fluoreszenzkanälen zur Verfügung. Als Folge davon wurden die UltraRainbow Kalibrierungspartikel  (UltraRainbow Calibration Particles, URCP) mit erhöhter UV- und Far-Red Fluoreszenzintensität für die Leistungsverfolgung von Durchflusszytometern mit mehreren Lasern entwickelt. Zum Beispiel haben die UltraRainbow Kalibrierungspartikel eine hervorragende Auflösung in den UV-, Violett-, Grün-, Gelb-, Orange-, Rot-, Fernrot- und IR-Kanälen des Durchflusszytometers. Die URCP sind erhältlich in sechs Peaks, 3,8 µm oder 5,1 µm. Die Partikel sind insofern ähnlich wie die RCP, dass ein Kalibrierungsdiagramm für die URCP mit dem gleichen Verfahren erstellt wird. Die URCP haben jedoch einen breiteren Exzitationswellenlängenbereich und eine verbesserte Auflösung in den UV- und Fernrot-Kanälen.    Rainbow Fluoreszenzpartikel (RFPs): Rainbow Fluoreszenzpartikel (Rainbow Fluorescent Particles, RFP) enthalten Partikel einheitlicher Größe mit einer einzigen Intensität. Der einzelne Peak der RFP hat einen niedrigen Fluoreszenz- und Größenvariationskoeffizienten (CV). Daher sind sie nützlich für die Ausrichtung des optischen Systems des Durchflusszytometers in mehreren Kanälen. Zum Beispiel wird die Spherotech-Katalognummer RFP-30-5 für die Ausrichtung der FITC-, PE-, PETR-, PE-Cy5- und APC-Kanäle des Durchflusszytometers verwendet. Siehe Abbildung 5 für die Histogramme von Spherotech Kat. Nr. RFP-30-5. Die RFPs enthalten ähnliche Fluorophore wie die Rainbow Kalibrierungspartikel. Außerdem haben die RFP ähnliche Fluoreszenzintensitäten wie der hellste Peak der entsprechenden Rainbow Kalibrierungspartikel, mit Ausnahme von RFP-50-5, RFP-60-5, RFP-100-2 und RFP30-5A. Der RFP-30-5A hat in allen Kanälen die gleiche Fluoreszenzintensität wie gefärbte Zellen. Wählen Sie den untenstehenden Link, um die vollständige SpheroTECHNICAL NOTE herunterzuladen. (PDF format) STN-8: Calibration and Performance Tracking of Flow Cytometer Using SPHERO™ Calibration Particles

Zu den Hauptproblemen, die derzeit mit der systemischen Genvektorverabreichung (Gentherapie) verbunden sind, gehören die Biodistribution des Genvektors im gesamten Körper, die mangelnde Spezifität gegenüber einem pathologischen Ort (Bioverfügbarkeit am Zielort), die Notwendigkeit einer hohen Dosis, um eine hohe lokale Konzentration zu erreichen, die unspezifische Toxizität, die Inaktivierung der Vektoren aufgrund unerwünschter Wechselwirkungen mit Komponenten des in vivo-Milieus und andere Nebenwirkungen aufgrund hoher Vektordosen. Magnetofection™ löst die Probleme im Zusammenhang mit dem diffusionsbegrenzten Prozess und der eingeschränkten Bioverfügbarkeit am Zielort.   PRINZIP In vivo Magnetofection™ wurde für gezielte in vivo Transfektionen und Infektionen entwickelt. Dieses originale System kombiniert magnetische Nanopartikel und Nukleinsäurevektoren, die nach der Injektion an der magnetischen Zielstelle zurückgehalten werden. Auf diese Weise minimiert die gezielte Abgabe die systemische Verteilung und reduziert die Toxizität. Darüber hinaus verstärkt die magnetische Kraft die Aufnahme von magnetischen Nanopartikeln durch das Zielgewebe und verbessert so die Effizienz der Transfektion oder Transduktion. Dadurch können die erforderlichen Nukleinsäure- oder Virusdosen und die Prozesszeit der Verabreichung reduziert werden, was für die Verbesserung der in vivo Nukleinsäureverabreichung entscheidend ist.     ANWENDUNGEN Drei optimierte In-vivo-Magnetofektions-Reagenzien wurden für definierte Anwendungen entwickelt: In vivo PolyMag (/In vivo DogtorMag), In vivo ViroMag, In vivo SilenceMag. Nicht-virale Anwendungen: In vivo PolyMag, eine auf kationischen Polymeren basierende Formulierung von magnetischen Nanopartikeln, und In vivo DogtorMag, eine auf kationischen Lipiden basierende Formulierung von magnetischen Nanopartikeln, wurden für die gezielte in vivo Transfektion verschiedener Arten von Nukleinsäuren wie DNA, RNA und Oligonukleotiden entwickelt. Virale Anwendungen: In vivo ViroMag ist eine optimierte Formulierung von Nanopartikeln, die speziell für virale Vektoren entwickelt wurde und eine Reduktion des Titer-Virus ermöglicht. Es eignet sich besonders für lentivirale/retrovirale, adenovirale und Adeno-Associated-Viral (AAV)-Vektoren. Gen-Silencing: In vivo SilenceMag ist eine schnelle, einfache und hocheffiziente Methode zur Transfektion kleiner RNA (siRNA, miRNA) in Zielzellen/Gewebe in vivo.   VERWENDUNG DER IN VIVO MAGNETOFECTION™ REAGENZIEN Genvektoren/Nanopartikel-Komplexe können leicht über verschiedene Injektionswege verabreicht werden, z.B: Systemische Verabreichung (intravenös, intraarteriell), Lokale Verabreichung (intratumoral, intrazerebroventrikulär, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan). Der Magnet kann positioniert werden: Äußerlich für große Organe oder isolierte Organe (Leber, Gehirn, Muskel, subkutaner Tumor) Innerlich für tiefe Organe oder fokalisierten Gentransfer   >> Weitere Informationen bei unserem Partner OZ Biosciences

Gewebesektionierung, Deparaffinierung und Rehydrierung Paraffinblöcke mit dem Mikrotom in 4-Mikron-Schnitte schneiden und auf geladene Objektträger legen (Fisher, ProbeOn, Kat. #22230900). Objektträger in einem Gewebetrockenofen 45 Minuten lang bei 60°C erhitzen. Waschen Sie die Objektträger 3x in Xylol für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur. Objektträger 3x mit 100%igem Alkohol jeweils 3 Minuten lang bei Raumtemperatur waschen. Objektträger 2x mit 95%igem Alkohol jeweils 3 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Waschen der Objektträger in 80%igem Alkohol für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Objektträger 5 Minuten lang in fließendem destilliertem Wasser bei Raumtemperatur spülen. Die folgenden Schritte sind bei Raumtemperatur durchzuführen. Die Gewebe zu keinem Zeitpunkt während des Färbevorgangs trocknen lassen. Antigen-Entnahme Objektträger in 1X TBS mit Tween (TBST) 1 Minute lang spülen. Eine Arbeitslösung von Proteinase K (DAKO, Kat. #S3020) auf die Objektträger auftragen und 10 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen.   Immunfärbung mit dem AP-Vektorrot-Nachweissystem Universal Protein Block (DAKO, Kat. #X0909) auf die Objektträger auftragen und 20 Minuten inkubieren. Proteinblock von den Objektträgern ablaufen lassen. Verdünnten Primärantikörper auf die Objektträger auftragen und 45 Minuten inkubieren. Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen und inkubieren. Einen biotinylierten Sekundärantikörper auf die Objektträger (spezifisch für den Wirt des Primärantikörpers) auftragen und 30 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. Alkalische Phosphatase Streptavidin (Vektor, Kat. #VEC-AK-5000) auf die Objektträger auftragen und 30 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. Alkalisches Phosphatase-Chromogen-Substrat (Vektor, Kat. #VEC-AK-5000) auf die Objektträger auftragen und 30 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang in destilliertem Wasser waschen.   Immunfärbung mit dem HRP-DAB-Nachweissystem Peroxidase-Block (3% Wasserstoffperoxid) auf die Objektträger auftragen und 5 Minuten inkubieren. Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. Universal Protein Block (DAKO, Kat. #X0909) auf die Objektträger auftragen und 20 Minuten inkubieren. Proteinblock von den Objektträgern ablaufen lassen. Primärantikörper auf die Objektträger auftragen und 45 Minuten inkubieren. Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. LSAB2 System-HRP LINK-Lösung (DAKO, Kat. #K0679) auf die Objektträger auftragen und 15 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. LSAB2 System-HRP Streptavidin-HRP Lösung (DAKO, Kat. #K0679) auf die Objektträger auftragen und 10 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang in 1X TBST spülen. Vorbereitete DAB-Substrat-Chromogen-Lösung (DAKO, Kat. #K3468) auf die Objektträger auftragen und 5 Minuten inkubieren. Die Objektträger 1 Minute lang mit 1X TBST spülen. Gegenfärbung mit Hämatoxylin Färbung der Objektträger mit 65% Harris' Hämatoxylin für 1 Minute. Hämatoxylin färbt Nukleinsäuren (Kerne) tief blau-violett. Dehydrierung und Deckfärbung Diese Methode sollte nur angewendet werden, wenn das verwendete Chromogensubstrat alkoholunlöslich ist (z.B. Vektorrot oder DAB). Waschen Sie die Objektträger in 2 Wechseln mit 80% Alkohol jeweils 1 Minute lang. Waschen Sie die Objektträger in 2 Wechseln mit jeweils 95% Alkohol für jeweils 1 Minute. Waschen der Objektträger in 3 Wechseln mit jeweils 100% Alkohol für jeweils 1 Minute. Waschen der Objektträger nach 3 xylenen Wechseln für jeweils 1 Minute. Deckgläser mit einem Tropfen eines permanenten Rahmungsmediums auftragen.

        Beschrieben ist das immunhistochemische Standardprotokoll von Atlas Antibodies, das für Triple-A-Polyklonale und PrecisA-Monoklonale optimiert ist.   Entparaffinierung Paraffinschnitte von 4 µm Dicke werden über Nacht bei 50°C inkubiert. Vor der Immunfärbung werden Entparaffinierung und Hydratisierung in Xylol und abgestuftem Ethanol zu destilliertem Wasser durchgeführt und während der Hydratisierung eine 5-minütige Blockierung für endogene Peroxidase in 0,3% H2O2 in 95%igem Ethanol.    Antigen-Entnahme 1. Standard-Antigenentnahmeverfahren  Die Standardantigen-Entnahmemethode ist die hitzeinduzierte Epitop-Entnahme (Heat Induced Epitope Retrieval, HIER) in Entnahmepuffer pH 6 unter Verwendung eines Druckkessels (Enttarnungskammer, Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA) als Wärmequelle. HIER wird durchgeführt, indem die in den Entnahmepuffer eingetauchten TMA-Objektträger 4 Minuten lang bei 125°C im Druckkessel erhitzt werden. Nach Beendigung des Kochens verbleiben die Objektträger im Druckkessel und können auf 90°C abkühlen. Die gesamte Verarbeitungszeit beträgt etwa 45 Minuten. HINWEIS: Die angegebenen Arbeitsverdünnungen der Primärantikörper sind nur als Richtwert zu betrachten. Die optimalen Verdünnungen müssen vom Anwender bestimmt werden. 2. Alternative Methoden zur Antigengewinnung Für ausgewählte Antikörper können alternative Entnahmepuffer und/oder enzymatische Antigenentnahme verwendet werden, wie im Produktdatenblatt und auf der Antikörper/Antigen-Informationsseite des Humanprotein-Atlas angegeben. Verfahren zur enzymatischen Antigengewinnung  Die enzymatische Entnahme erfolgt mit dem Immunfärbungsgerät unter Inkubation von TMA-Objektträgern in Proteinase K (Lab Vision, Freemont, CA, USA) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wärmeinduzierte Epitop-Rückgewinnung (HIER) in Retrieval-Puffer pH 9 HIER in Rückholpuffer pH 9 wird als Standard-HIER durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Rückholpuffer mit pH 9 (Lab Vision, Freemont, CA, USA) anstelle von Rückholpuffer mit pH 6 verwendet wird.   Immunhistochemisches Färbeprogramm Färbeprogramm Autostainer 480 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle Reagenzien werden mit einem Volumen von 300 µl pro Objektträger aufgetragen. Spülen in Waschpuffer. Inkubation mit Ultra V Block für 5 min. Spülen in Waschpuffer (x2). Inkubation mit Primärantikörper für 30 min. Spülen in Waschpuffer (x3). Inkubation mit primärem Antikörper Enhancer für 20 min.* Spülen in Waschpuffer (x2). Inkubation mit markiertem Polymer für 30 Min.* Spülen in Waschpuffer (x2). Entwickeln in DAB-Lösung für 5 min. Spülen in destilliertem Wasser. Gegenfärbung in Hämatoxylin für 5 min.** Spülen in Leitungswasser für 5 Min. ** Spülen in Li2CO3-Wasser, 1:5 verdünnt aus gesättigter Lösung für 1 Min.** 5 Min. lang in Leitungswasser spülen*. Dehydrierung in abgestuftem Ethanol und Xylol** Mit Deckglas abdecken. * Bei polyklonalen Antikörpern die Schritte 6 und 7 außer Acht lassen. ** Die Schritte 14 -16 werden mit einem Histofärbungsgerät (Leica Autostainer XL) durchgeführt.   Reagenzien Für die Immunhistochemie sind die folgenden Reagenzien von Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA, im Handel erhältlich: Waschpuffer (10x Konzentrat). Arbeitslösung enthält ursprünglich 0,05% (v/v) Tween 20. Extra Tween 20 wird bis zu einer Endkonzentration von 0,20% zugegeben. Retrieval-Lösung: Zitratpuffer®, pH 6. Antikörper-Verdünnungsmittel. UltraVision LP HRP-Polymer®, Primärer Antikörper Enhancer (nur für monoklonale Antikörper), Ultra V Block und DAB Quanto Chromogen- und Substratsystem®. Darüber hinaus werden Mayer's Hämatoxylin und Xylol (Histolab, Göteborg, Schweden) verwendet.