Anti-Hapten Konjugate in immunhistologischen Färbungen
Anti-Hapten-Systeme können sehr gut in Mehrfachmarkierungen mit haptenylierten Primärantikörpern eingesetzt werden (Abb. 1). Besonders dann, wenn sich Primärantikörper nicht mit Spezies- oder Subklassen-spezifischen Sekundärantikörper-Konjugaten unterscheiden lassen, garantieren sie eine empfindliche und differenzierte Darstellung der Antigene.
Fluorescein-anti-Fluorescein-Markierungen
Anti-Fluorescein Antikörper bilden neben ihrer besonderen Eignung für Mehrfachmarkierungen eine hervorragende Grundlage für die nachfolgende Signalverstärkung durch Markerenzyme, Fluoreszenz- und Immungold-Markierungen. Ein wesentlicher Vorteil von Fluorescein-anti-Fluorescein Techniken gegenüber anderen Hapten-anti-Hapten-Verfahren sowie (Strept)Avidin-Methoden besteht darin, dass Hapten-Signale detektiert werden können oder ihre Konzentration durch Absorption in Lösung messbar ist, bevor der sekundäre Nachweisschritt folgt. Außerdem kann durch ein auf Fluorescein-anti-Fluorescein basiertes Nachweissystem unerwünschte Hintergrundfärbung zelleigenen Biotins umgangen werden.
Abbildung 1: Peroxidase-markierte Antikörper gegen Fluorescein erlauben die Umwandlung des Fluoreszenz-Signals Fluorescein-konjugierter Nachweisreagenzien in ein lichtmikroskopisch sichtbares und elektronendichtes Reaktionsprodukt (Abb. 2). Der Einsatz dieser Konjugate steigert die Nachweisempfindlichkeit erheblich, erfordert aber auch eine sorgfältige Optimierung der Konzentration von Fluorescein-konjugierten Markern. So reicht bereits ein Zehntel der für die Durchflusszytometrie angegebenen Einsatzkonzentration eines Fluorescein-konjugierten CD-Markers, um in einer immunhistochemischen Färbung mit Peroxidase-konjugiertem anti-Fluorescein Antikörper ein deutliches Signal zu erhalten (Abb. 2). Konjugate aus Markerenzymen und anti-Fluorescein Antikörper lassen sich außerdem in ELISAs oder zum Nachweis Fluorescein-markierter Proben auf Blot-Membranen einsetzen.
Abbildung 2: Konvertierung von Fluoreszenz in ein lichtmikroskopisch sichtbares Reaktionsprodukt.(A) Mikroglia in autoptischem corticalen Hirngewebe. Umwandlung der relativ schwachen Fluoreszenz-Markierung mit Fluorescein anti-CD45 durch Peroxidase-markierten anti-Fluorescein Antikörper (#200-032-037) und das Chromogen Nickel-verstärktes Diaminobenzidin (DAB). (B) Perineuronale Netze der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Konversion grünfluoreszierender Lektin-Bindungsstellen für Fluorescein-markiertes Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) durch Peroxidase-konjugierten anti-Fluorescein Antikörper (# 200-032-037) und Nickel-verstärktes DAB.
Abbildung 3: Mit Alexa Fluor 488 oder anderen Grünfarbstoffen markierte anti-Fluorescein Antikörper eignen sich dazu, die Grünfluoreszenz des an einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder anderen Biomoleküls gekoppelten Haptens Fluorescein zu verstärken, ohne dessen Fluoreszenzfarbe zu ändern. Fluorescein-gekoppelte Marker sind bei nachträglicher Amplifizierung in einer höheren Verdünnung einsetzbar als ohne Signalverstärkung. Darüber hinaus ist die Alexa Fluor 488-Fluoreszenz weniger empfindlich gegenüber Fading als die des Fluoresceins. Abgebildet ist ein Perineurales Netz der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Farbverstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein-konjugiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) mit grün-markiertem anti-Fluorescein Antikörper (z.B. # 200-542-037 ).
Abbildung 4: Mit leuchtenden Rotfarbstoffen wie Cy3 markiertes anti-Fluorescein kann genutzt werden, um die Grünfluoreszenz eines Fluorescein-Konjugates in eine photostabile Rot-Fluoreszenz umzuwandeln und dadurch das Signal von Fluorescein-Konjugaten zu verstärken. Umwandlung der Grünfluoreszenz in ein stabil rot fluoreszierendes Signal. Doppelmarkierung eines perineuronalen Netzes der extrazellulären Matrix (rot) und Blutgefäßen (blau) im Ratten-Neocortex. Netzdarstellung mit Fluorescein-markiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) gefolgt von Cy3-markiertem anti-Fluorescein Antikörper. Gefäßmarkierung mit biotinyliertem Kartoffel-Lektin (Solanum tuberosum Agglutinin) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084).
Abbildung 5 Hapten-anti-Hapten-Mehrfach-Markierung. Gemeinsam mit anti-Digoxin oder anti-Biotin (oder Streptavidin) können anti-Fluorescein-Konjugate für Doppel- und Mehrfachfärbungen mit Hapten-konjugierten Markern eingesetzt werden. Peroxidase-Konjugate von Antikörpern gegen Haptene ermöglichen in CARD-Nachweissystemen im Zusammenspiel mit Fluoreszenz-markierten Tyramid-Derivaten eine erheblich verbesserte Nachweisempfindlichkeit. Dreifachmarkierung von Gefäßen, perineuronalen Netzen der extrazellulären Matrix und Astroglia im Cortex der Ratte. Die Färbung der Blutgefäße (blau) erfolgte mit biotinyliertem Lektin (Solanum tuberosum) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084). Perineuronale Netze (grün) wurden mit Fluorescein-markiertem Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) und nachfolgend grün-markiertem anti-Fluorescein (z.B. # 200-542-156) dargestellt, während digoxigenyliertes anti-GFAP und Cy3-konjugiertes anti-Digoxin (200-162-156) der Detektion von Astroglia diente.
Literatur:
Abbildungsnachweis: (*1) Alle abgebildeten Präparate stammen von Wolfgang Härtig aus dem Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung (PFI) der Universität Leipzig. Die Abbildungen von Fluoreszenzmarkierungen wurden an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) 510 Meta von Jens Grosche (PFI) angefertigt. (*2) Die Aufnahmen der Immunperoxidase-Markierungen erfolgten durch Uli Gärtner (PFI) an einem Axiophot, ausgestattet mit einer AxioCam HRC sowie dem Programm AxioVision 3.1.2.1.