Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen und -konjugaten für Sekundärantikörper

 

Die Auswahl der Fluorochrome für Immunfluoreszenzfärbungen ist abhängig von:

 

1. der Einstellung und der Ausstattung des Instrumentes, z.B. Verfügbarkeit von Lichtquellen, Filtersets und Detektionssystemen.

2. dem gewünschten Grad der Farbtrennung bei Mehrfachfluoreszenz-Markierungen: Rhodamin Red-X, Alexa Fluor 594 oder Alexa Fluor 647 geben beispielsweise eine bessere Trennung von Alexa Fluor 488 oder FITC als Cy3.

3. dem Expressiongrad des Antigens: für gering exprimierte Antigene ein leuchtintensiveres Fluorochrom als für stark exprimierte Antigene auswählen.

4. der erforderlichen Sensitivität. So sind Alexa Fluor 488, Cy3, Alexa Fluor 594 und Alexa Fluor 647 leuchtintensiver als FITC, Cy2, TRITC, Rhodamin-Red X, Texas Red und Cy5.

 

 

Bei der Wahl des Detektionssystems gibt es weitere Faktoren zu berücksichtigen:

 

Mikroskopie

Zu beachten:   Penetration des Probenmaterials Autofluoreszenz des Probenmaterials pH-Bereich Polares (wässriges) oder nicht-polares (plastisches) Eindeckmedium Expressionslevel des Analyt ⇒ Verwenden Sie einen helleren Farbstoffe für schwach exprimierte Targets

 

Mikroskopie (Mehrfachfärbung)

Zu beachten:   Spektrale Überlappung von Fluorophoren Verfügbare Filtersets (Mikroskop) Expressionslevel des Analyt ⇒ Verwenden Sie einen helleren Farbstoffe für schwach exprimierte Targets

 

Super-Resolution Mikroskopie (STORM und STED)

Zu beachten:   Hohe Emission durch STED-Laser erzielt hohe Sättigung Helligkeit Photoswitch Fotostabilität

 

Durchflusszytometrie

Zu beachten:   Größere und hellere Fluoreszenzproteine wie R-PE, APC, PerCP oder die Brilliant Violet Konjugate eignen sich für die Markierung von Oberflächenproteinen. Kleinere Fluoreszenzfarbstoffe können sowohl für die Detektion von Oberflächenproteinen als auch für intrazelluläre Färbungen eingesetzt werden.

 

Western Blot und Dot Blot

Zu beachten: Tief-/Infrarot Fluoreszenzfarbstoffe für hohe Sensitivität Spektrale Überlappung

 

 

Verfügbare Fluorochrome für die Histo-/Cytochemie und Durchflusszytometrie

 

	Fluorochrom	Amax [nm]	Emax [nm]	Farbe	Antikörper-Verdünnung
DyLight 350	DyLight 350	353	432	Blue-Violet	1:100 – 1:800
DyLight 405	DyLight 405	400	421	Blue-Violet	1:100 – 1:800
BV 421	Brilliant Violet 421	407	421	Blue-Violet	1:50 – 1:200
AMCA	Aminomethylcoumarin-Acetat	350	450	Blue	1:50 – 1:200
BV 480	Brilliant Violet 480	436	478	Blue	1:50 – 1:200
Cy2	Carbocyanin	492	510	Green	1:50 – 1:200
DyLight 488	DyLight 488	493	518	Green	1:100 – 1:800
IFKine™ Green	IFKine™ Green	493	518	Green	1:50 – 1:1000
Alexa 488	Alexa Fluor 488	493	519	Green	1:100 – 1:800
FITC	Fluorescein /-Isothiocyanat)	492	520	Green	1:50 – 1:200
Cy3	Indocarbocyanin	550	570	Yellow	1:100 – 1:800
IFKine™ Orange	IFKine™ Orange	555	570	Yellow	1:50 – 1:1000
TRITC	Tetramethylrhodamin	550	576	Yellow	1:50 – 1:200
DyLight 550	DyLight 550	562	576	Yellow	1:100 – 1:800
R-PE	R-Phycoerythrin	490/545/566	580	Orange-Red	1:50 – 1:200
RRX	Rhodamin Red X	570	590	Orange-Red	1:50 – 1:200
Alexa 594	Alexa Fluor 594	591	614	Red	1:100 – 1:800
IFKine™ Red	IFKine™ Red	591	615	Red	1:50 – 1:1000
DyLight 594	DyLight 594	593	618	Red	1:100 – 1:800
Texas Red	Texas Red	596	620	Red	1:50 – 1:200
DyLight 633	DyLight 633	638	658	Red	1:100 – 1:800
APC	Allophycocyanin	650	660	Near-Infrared	1:50 – 1:200
Alexa 647	Alexa Fluor 647	651	667	Near-Infrared	1:100 – 1:800
Cy5	Indodicarbocyanin	650	670	Near-Infrared	1:100 – 1:800
PerCP	Peridinin-Chlorophyll	482	676	Near-Infrared	1:50 – 1:200
Alexa 680	Alexa Fluor 680	684	702	Near-Infrared	1:100 – 1:800
DyLight 680	DyLight 680	692	712	Near-Infrared	1:100 – 1:800
DyLight 800	DyLight 800	777	794	Infrared	1:100 – 1:800
Alexa 790	Alexa Fluor 790	792	803	Infrared	1:100 – 1:800

 

Die früher erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe Cy2 und DyLight 488 bzw. Cy5 und DyLight 647 sind durch die Farbstoffe Alexa 488 bzw. Alexa 647 ersetzt worden, ebenso wie DyLight 594 durch Alexa 594. Im orangen Emissionsbereich sind die fluoreszenzstarken Cy3-Konjugate von Jackson ImmunoResearch erhältlich. DyLight-Konjugate sind jetzt von unserem Partner ImmunoReagents erhältlich.

 

 

Beispielprotokoll 3-fach Markierung

Multiple Labeling with Secondary Antibodies

Schwerpunkt Fluoreszenzfarbstoffe

Fluorescent Dyes for Secondary Antibodies

 

Keine Materialverluste bei Färbung seltener Zell- und Gewebeproben   Wirkungsvolles Immobilisieren von Zell- und Gewebeproben beugt Verlusten wertvollen Probenmaterials durch Wasch- und Färbeschritte vor. Immunoselect® Adhäsionsobjektträger ermöglichen schnelle und starke Haftung von Proben durch einfaches Auftropfen ohne zusätzliche Zentrifugation, Trocknung oder Fixierung. Die neuartige Haftbeschichtung der Objektträger reagiert mit den natürlichen Oberflächenstrukturen von Zellen und Geweben und verankert diese über verschiedene Bindungsprinzipien dauerhaft auf der Glasoberfläche. ImmunoSelect Adhäsionsobjektträger verhindern ein Abschwemmen von Proben unter extremsten Inkubationen bei vollem Erhalt der Antigenität.   Blitzschnelles Anheften von Zellen und Gewebeschnitten mit hohen Ausbeuten > 95% Neuartige Alternative zu Polylysin und anderen Adhäsionsverfahren Keine Cytospins oder Ausstriche notwendig, Zellen auftropfen und absinken lassen Zelladhäsion resistent gegen Hitze, Färbungen und Denaturierung Kein Zellverlust selbst bei harschen zytologischen Färbetechniken Überragender Erhalt der Zell- und Gewebemorphologie

 

Optimales Eindecken für mehr Fluoreszenzstablität und Signalschärfe   Um Ausbleichen zu verhindern und die Signalstärke zu erhalten, eignet sich für Mehrfachmarkierungen mit allen Fluoreszenzfarbstoffen als universelles Eindeckmedium ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium. Die Zusammensetzung des Mediums verhindert das häufige Problem der Autofluoreszenz von Eindeckmedien. Durch eine starke Anfangsfluoreszenz, kombiniert mit sehr guten Antifading-Eigenschaften und keinerlei Autofluoreszenz in den relevanten Spektralbereichen garantiert ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium klare Signale mit hoher Kontrastschärfe.

 

Fluoreszenzkonjugate der Sekundärantikörper

 

Alle Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch Labs werden immunaffinitätschromatographisch durch Adsorption an agarosegekoppelte Antigene aus Antiseren isoliert. Das patentierte sequentielle Elutionsverfahren (AffiniPure) von Jackson ImmunoResearch Labs sorgt für eine schonende Ablösung der Antikörper vom Antigen, woraus Antikörper mit idealen Bindungseigenschaften resultieren.

 

Weitere Festphasenadsorptionen an Serumproteine verschiedenster Spezies sowie an IgG, IgM, IgA und IgG-Fragmente eliminieren Kreuzreaktionen und stellen die Ig-spezifische Reaktivität der Sekundärantikörper sicher.

 

Die Nachweisintensität jedes Fluorochrom-Antikörper-Konjugats hängt außer von den Bindungseigenschaften des Antikörpers von der Helligkeit und Fotostabilität des Farbstoffs sowie dem optimalen Verhältnis von Farbstoffmolekülen pro Antikörper ab. Für die Herstellung von Fluoreszenzkonjugaten mit bestmöglicher Nachweisstärke und minimalem Hintergrund werden daher für jeden Farbstoff molare Sättigungskurven vs. Fluoreszenzintensität, Antikörperaktivität, Hintergrundfärbung u. a. Parametern erstellt und anhand dieser Daten eine optimale Farbstoffkopplung ermöglicht.

 

Die Fluoreszenzkonjugate von Jackson ImmunoResearch Labs werden gefriergetrocknet in 0,01 M Natriumphosphat / 0,25 M NaCl pH 7,6 mit 15 mg/ml BSA / 0,05 % Natriumazid geliefert. Vor erstmaligem Gebrauch Fluoreszenzkonjugat gemäß Datenblattangaben in Aqua dest. auflösen.

 

 

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Alexa Fluor®, Rhodamin RedTM-X und Texas Red® sind eingetragene Marken von Life Technologies, Inc.*. Cy™ ist eine Marke von GE Healthcare (Patent 5.268.486). Brilliant Violet™ ist ein Markenzeichen von Sirigen Inc., a Becton, Dickinson and Company affiliate. DyLight™ ist ein Markenzeichen von Thermo Fisher Scientific. Über alle Farbstoffe und deren Farbstoffprodukte besitzt Jackson ImmunoResearch Labs mit den genannten Firmen Lizenzvereinbarungen zu den Farbstoff-Technologien bezüglich Verwendung, Herstellung, Handel und Verkauf.
* Konjugate dieser Farbstoffe sind nicht zur Verwendung für kommerzielle Zwecke (Weiterherstellung, Diagnostik, Therapie, Auftragsbestimmung o. a.) bestimmt. Für Lizenz-Informationen zur Verwendung für andere Zwecke als der Forschung: Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008.