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VHH-Einzeldomänen-Antikörper (NANOBODIES®)

 

Zweitantikörper aus Alpaka von Jackson ImmunoResearch sind als polyklonaler Gesamtcocktail und als VHH-Einzeldomänen-Antikörper (Nanobodies®) erhältlich.

 

Cameliden wie Alpakas und Lamas produzieren eine Klasse von Antikörpern, die ausschließlich aus schweren Ketten bestehen (siehe Abb. 1) und die unter Säugetieren eine einzigartige Klasse von Immunglobulinen darstellt. In ihrem Serum finden sich drei IgG-Subklassen: das herkömmliche IgG1 sowie IgG2 und IgG3. Letzten beiden fehlt die leichte Kette und die erste konstante Domäne (CH1) (Abb. 1). Diese ausschließlich aus schweren Ketten bestehenden Antikörper sind kleiner als normale IgGs, aber robust und weisen volle Spezifität und Affinität zu ihren jeweiligen Antigenen auf.

Diese Antigen-bindenden Fragmente, auch bekannt als VHH-Antikörper (Variable Heavy-Chain-Only-Fragmente) oder NANOBODIES®, stellen ein innovatives Antikörperformat dar. Mit ihrer geringen Größe von 15 kDa sowie ihrer außergewöhnlichen Spezifität und ihren hervorragenden Penetrationseigenschaften bieten VHH-Fragmente eine hervorragende Lösung für die hochwertige, hochauflösende Darstellung. Die AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch sind spezialisierte Detektionsreagenzien, die die einzigartigen Eigenschaften von VHH-Fragmenten nutzen, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen.

 

 

Abb. 1: Schematische Darstellung von konventionellem IgG (links), einem ausschließlich aus schweren Ketten bestehenden Alpaka-IgG2/IgG3-Antikörper und einem VHH-Einzeldomänen-Antikörper (rechts).

 

Einzeldomänen-VHH-Antikörper (NANOBODIES®) von Jackson ImmunoResearch

 

Die AffiniPure™ VHH®-Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch sind polyklonale VHH-Fragment-Antikörper (Nanobodies®), die in Alpakas gewonnen werden. Sie sind mit Spezifität für Mensch, Kaninchen oder Maus erhältlich. Da sie zehnmal kleiner sind als herkömmliche IgG-Antikörper, eignen sich diese 15 kDa schweren VHH-Fragment-Antikörper ideal für Immunhistochemie-Experimente, die eine gute Durchdringung erfordern. Die AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch werden kreuzadsorbiert, um eine hervorragende Spezifität gegenüber der Zielspezies bei minimaler Kreuzreaktivität mit anderen häufig verwendeten Spezies zu gewährleisten. Dadurch eignen sie sich für den Einsatz in Mehrfachmarkierungsexperimenten. Jackson ImmunoResearch Single-Domain-VHH-Antikörper sind konjugiert mit Reporterenzymen und einer Reihe von Fluoreszenzfarbstoffen, darunter Alexa Fluor®, erhältlich und bieten damit Möglichkeiten für hochauflösende Immunhistochemie und Immunfluoreszenz.

 

Die geringe Größe ermöglicht eine Darstellung mit höherer Auflösung

 

Obwohl die direkte Markierung mit NANOBODIES® die kleinstmögliche Größe für einen Antikörper-Antigen-Komplex bietet, ist dieser Ansatz aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von im Handel erhältlichen NANOBODIES®, die gegen einzelne Zielproteine gerichtet sind, nicht immer möglich. 

Forscher können jedoch die geringere Größe des Antikörper-Nanokörper-Komplexes nutzen, indem sie Sekundärantikörper vom Hersteller Jackson ImmunoResearch (AffiniPure VHH®) einsetzen. Durch Hinzufügen eines indirekten Nachweisschritts vergrößert sich der Durchmesser des Bindungskomplexes nur geringfügig. Dadurch bleibt der Abstand zwischen der Sonde und dem Zielprotein relativ gering, was im Vergleich zu herkömmlichen Nachweiskomplexen aus Primär- und Sekundärantikörpern eine wesentlich genauere Lokalisierung der Zielantigene ermöglicht.


 

Schematische Darstellung zum Vergleich des Linkage-Fehlers bei der direkten NANOBODY®-Färbung mit der indirekten Färbung mit IgG+AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörpern (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)

 

Vorteile von polyklonalen gegenüber monoklonalen NANOBODIES®

 

Im Gegensatz zu vielen anderen derzeit verfügbaren Single-Domain-VHH-Antikörpern bieten NANOBODIES® von Jackson ImmunoResearch den zusätzlichen Vorteil, dass sie polyklonal sind. Polyklonale Single-Domain-VHH-Antikörper ermöglichen eine noch bessere Signalverstärkung und weisen im Vergleich zu monoklonalen Nanobodies dieselbe Reduzierung des Linkage-Errors auf. Sie bieten eine heterogene Population von Antikörpern, von denen jeder ein anderes Paratop aufweist, das einen spezifischen Teil des Primärantikörpers erkennt.

Die einzigartigen CDR (Complementarity Determining Regions) von VHH-Fragmenten ermöglichen Berichten zufolge den Zugang zu Antigen-Epitopen, die für herkömmliche Antikörper sonst nicht erreichbar sind (Bannas et al. 2017). Beispielsweise könnte die lange Schleifenstruktur des VHH-Fragments CDR3 die Bindung an Taschen auf der Proteinoberfläche erleichtern.

 

 

Diese schematische Darstellung zeigt, wie die Anzahl der polyklonalen AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörper, die an einen Primärantikörper binden können, im Vergleich zu monoklonalen NANOBODIES® erhöht ist. Da der polyklonale AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörper nicht an eine bestimmte Stelle, Region oder Sequenz, sondern an den gesamten Primärantikörper bindet, kann er diesen umfassend überziehen, was eine höhere Markierungseffizienz und ein stärkeres Signal ermöglicht. (Bild: Jackson Immuno Research).

 

NANOBODIES® dringen besser in das Gewebe ein als herkömmliche Sekundärantikörper

 

NANOBODIES® zeichnen sich aufgrund ihrer geringen Größe durch eine hervorragende Gewebedurchdringung aus (Chakravarty et al., 2014; Debie et al., 2020; Hernández et al., 2019), wodurch sie sich mit einem Diffusionskoeffizienten, der unter dem herkömmlicher Antikörper liegt, frei durch das Gewebe bewegen können (Jovčevska & Muyldermans, 2019).

Zudem ist die unspezifische Bindung über die Fc-Region eine der häufigsten Ursachen für Hintergrundsignale bei Gewebefärbungen und Zellassays. Das Fehlen einer fragmentkristallisierbaren (Fc) Region verbessert die Entfernung des Moleküls aus dem Gewebe bei den Waschschritten, wodurch NANOBODIES® zu einem hervorragenden Werkzeug für diagnostische Bildgebungsverfahren wie die Immun-PET werden (Krasniqi et al., 2018). AffiniPure-VHH®-Sekundärantikörper nutzen diese einzigartigen Eigenschaften und ermöglichen eine hervorragende Gewebepenetration und -clearance, ohne dass längere Inkubationszeiten oder potenziell schädliche Detergenzien zur Beseitigung dieses Hintergrundsignals erforderlich sind.

Aufgrund ihrer geringen Größe können NANOBODIES®, denen das Fc-Fragment fehlt, zur Immunfärbung lebender Zellen verwendet werden (Lelek et al., 2021). Im Vergleich dazu können herkömmliche Immunglobuline mit Fc-Fragmenten biologische Funktionen beeinträchtigen.

 

Jackson ImmunoResearch's NANOBODIES® are cross-adsorbed for improved specificity and reduced background

Die NANOBODIES® von Jackson ImmunoResearch werden zur Verbesserung der Spezifität und zur Verringerung des Hintergrundsignals kreuzadsorbiert. Hier erfahren Sie mehr über die Kreuzadsorbtion und warum diese wichtig ist

 

Die NANOBODIES® von Jackson ImmunoResearch sind in einer Vielzahl von Konjugationen erhältlich 

 

Die NANOBODIES® von Jackson ImmunoResearch sind in einer Vielzahl von Konjugationen erhältlich, darunter Fluoreszenzfarbstoffe über das gesamte Spektrum. Zu den Fluorophoren gehören Farbstoffe von Ultraviolett bis Fernrot, was Forschern maximale Flexibilität bei der Konzeption von Experimenten bietet, insbesondere bei der Identifizierung mehrerer Zielproteine.

 

Nanobodies finden ...

 

Ebenfalls bei Jackson ImmunoResearch erhältlich: polyklonale Sekundärantikörper aus Alpakas:

Die polyklonalen Alpaka-Sekundärantikörper (kompletter Satz aus IgG1, IgG2 und IgG3) von Jackson ImmunoResearch erkennen Kaninchen-IgG (H+L), Maus-IgG (H+L) oder Human-IgG (H+L). Um unspezifische Hintergrundfärbungen aufgrund der BSA-Blockierung zu vermeiden, wurden alle Antikörper gegen Rinderserumproteine kreuzadsorbiert. Darüber hinaus weisen sie keine Kreuzreaktivität mit Kaninchen, Maus oder Mensch auf, je nach Ihrer Wahl der Speziesreaktivität. Hier finden Sie Anti-Alpaka-Antikörper.

Benötigen Sie ein Blockierungsreagenz? Alpaca Normal Serum zum Blockieren ist bei BIOZOL erhältlich.

 

Referenzen:

 

  • Hamers-Casterman, C., T. Atarhouch, S. Muyldermans, G. Robinson, C. Hamers, E.B. Songa, N. Bendahman, and R. Hamers. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363:446–448
  • De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol (2006) 30:187–98.10.1016/j.dci.2005.06.010
  • Maass DR, Sepulveda J, Pernthaner A, Shoemaker CB. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). J Immunol Methods (2007) 324:13–25.10.1016/j.jim.2007.04.008
  • Bannas, P., Hambach, J. and Koch-Nolte, F., 2017. Nanobodies and Nanobody-Based Human Heavy Chain Antibodies As Antitumor Therapeutics. Frontiers in Immunology, 8.
  • Barakat, S., Berksoz, M., Zahedimaram, P., Piepoli, S. and Erman, B., 2022. Nanobodies as molecular imaging probes. Free Radical Biology and Medicine,.
  • Beltrán Hernández, I., Rompen, R., Rossin, R., Xenaki, K., Katrukha, E., Nicolay, K., van Bergen en Henegouwen, P., Grüll, H. and Oliveira, S., 2019. Imaging of Tumor Spheroids, Dual-Isotope SPECT, and Autoradiographic Analysis to Assess the Tumor Uptake and Distribution of Different Nanobodies. Molecular Imaging and Biology, 21(6), pp.1079-1088.
  • Carrington, G., Tomlinson, D. and Peckham, M., 2019. Exploiting nanobodies and Affimers for superresolution imaging in light microscopy. Molecular Biology of the Cell, 30(22), pp.2737-2740.
  • Chakravarty, R., Goel, S. and Cai, W., 2014. Nanobody: The “Magic Bullet” for Molecular Imaging?. Theranostics, 4(4), pp.386-398.
  • Croop, B., Zhang, C., Lim, Y., Gelfand, R. and Han, K., 2019. Recent advancement of light‐based single‐molecule approaches for studying biomolecules. WIREs Systems Biology and Medicine, 11(4).
  • De Groeve, K., Deschacht, N., De Koninck, C., Caveliers, V., Lahoutte, T., Devoogdt, N., Muyldermans, S., De Baetselier, P. and Raes, G., 2010. Nanobodies as Tools for In Vivo Imaging of Specific Immune Cell Types. Journal of Nuclear Medicine, 51(5), pp.782-789.
  • Debie, P., Lafont, C., Defrise, M., Hansen, I., van Willigen, D., van Leeuwen, F., Gijsbers, R., D'Huyvetter, M., Devoogdt, N., Lahoutte, T., Mollard, P. and Hernot, S., 2020. Size and affinity kinetics of nanobodies influence targeting and penetration of solid tumours. Journal of Controlled Release, 317, pp.34-42.
  • Erreni, M., Schorn, T., D’Autilia, F. and Doni, A., 2020. Nanobodies as Versatile Tool for Multiscale Imaging Modalities. Biomolecules, 10(12), p.1695.
  • Gormal, R., Padmanabhan, P., Kasula, R., Bademosi, A., Coakley, S., Giacomotto, J., Blum, A., Joensuu, M., Wallis, T., Lo, H., Budnar, S., Rae, J., Ferguson, C., Bastiani, M., Thomas, W., Pardon, E., Steyaert, J., Yap, A., Goodhill, G., Hilliard, M., Parton, R. and Meunier, F., 2020. Modular transient nanoclustering of activated β2-adrenergic receptors revealed by single-molecule tracking of conformation-specific nanobodies. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(48), pp.30476-30487.
  • Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Devoogdt, N., De Pauw, P., Vincke, C. and Muyldermans, S., 2013. Nanobodies and their potential applications. Nanomedicine, 8(6), pp.1013-1026.
  • Jovčevska, I. and Muyldermans, S., 2019. The Therapeutic Potential of Nanobodies. BioDrugs, 34(1), pp.11-26.
  • Krasniqi, A., D’Huyvetter, M., Devoogdt, N., Frejd, F., Sörensen, J., Orlova, A., Keyaerts, M. and Tolmachev, V., 2018. Same-Day Imaging Using Small Proteins: Clinical Experience and Translational Prospects in Oncology. Journal of Nuclear Medicine, 59(6), pp.885-891.
  • Kunz, P., Zinner, K., Mücke, N., Bartoschik, T., Muyldermans, S. and Hoheisel, J., 2018. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Scientific Reports, 8(1).
  • Lelek, M., Gyparaki, M., Beliu, G., Schueder, F., Griffié, J., Manley, S., Jungmann, R., Sauer, M., Lakadamyali, M. and Zimmer, C., 2021. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers, 1(1).
  • Noël F, Malpertuy A, de Brevern AG. Global analysis of VHHs framework regions with a structural alphabet. Biochimie. 2016 Dec;131:11-19. doi: 10.1016/j.biochi.2016.09.005. Epub 2016 Sep 6. PMID: 27613403.
  • Pleiner, T., Bates, M. and Görlich, D., 2017. A toolbox of anti–mouse and anti–rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology, 217(3), pp.1143-1154.
  • Pleiner, T., M. Bates, S. Trakhanov, C.T. Lee, J.E. Schliep, H. Chug, M. Böhning, H. Stark, H. Urlaub, and D. Görlich. 2015. Nanobodies: Site-specific labeling for super-resolution imaging, rapid epitope-mapping and native protein complex isolation. eLife. 4:e11349. https://doi.org/10.7554/eLife.11349
  • Shrestha, D., Jenei, A., Nagy, P., Vereb, G., & Szöllősi, J. (2015). Understanding FRET as a research tool for cellular studies. International journal of molecular sciences, 16(4), 6718–6756. https://doi.org/10.3390/ijms16046718

 

NANOBODY® and NANOBODIES® are registered trademarks of Ablynx N.V.
AffiniPure-VHH® is a trademark of Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.