Anti-armenischer Hamster

Antikörper

Antikörper gegen Hamster IgG

Nahezu alle monoklonalen Antikörper aus Hamstern stammen von Maus-armenischen Hamster-Hybridomen. Die von diesen Hybridomen produzierten IgG sind also „armenische“ und nicht „syrische“ IgG. Die meisten kommerziell erhältlichen polyklonalen anti-Hamster IgG-Antikörper sind gegen syrische Hamster-IgG gerichtet und detektieren monoklonale Antikörper aus armenischem Hamster daher nicht so wirkungsvoll wie anti-armenische Hamster IgG.

Anti-Schaf Antikörper

Nachweis von Antikörpern aus Schaf, Ziege und Rind

Zwischen IgG´s aus Schaf, Ziege und Rindern besteht weitgehend Homologie, so dass gegen Ziege generierte Sekundärantikörper auch für die Detektion von Primärantikörpern aus dem Schaf/Rind verwendet werden können. Anti-Schaf-Antikörper eignen sich auch für den Nachweis von Primärantikörpern aus Ziege/Rind.

Sekundärantikörper aus Ziege

Sekundärantikörper aus Esel

Erfahrungsgemäß sind Antikörper aus der Ziege oder dem Esel für den Nachweis von Primärantikörpern der meisten Spezies geeignet.

Bei indirekten Mehrfachmarkierungen mit unkonjugierten Primärantikörpern sollten alle Sekundärantikörper-Konjugate aus derselben Wirtsspezies stammen, damit Kreuzreaktionen der Sekundärantikörper untereinander vermieden werden. 

Bei Mehrfachmarkierungen sollte der Sekundärantikörper gegen weitere Spezies, die zusätzlich nachgewiesen werden, adsorbiert sein (s. Schritt Adsorption)!

Stark präadsorbierte Antikörper (siehe auch Schritt Adsorbtion) aus dem Esel sind zwar spezifischer als die weniger adsorbierten Sekundärantikörper aus anderen Wirtsspezies, können aus diesem Grund aber auch weniger sensitiv sein.

Um Hintergrund zu reduzieren, eignet sich zum Blockieren Normalserum aus der gleichen Spezies, aus der die Sekundärantikörper stammen, am besten!

Sekundärantikörper aus Rind / Bovin

Antikörper aus Rind zum Nachweis von Ziege Ig

Reagenzien, die im Labor verwendet werden, können in vielen Fällen Immunglobuline aus dem Rind enthalten. Dies gilt zum Beispiel für FCS in Zellkulturmedien, Milchpulver in Western Blot-Anwendungen oder BSA als Stabilisator für Proteine und Antikörper. Beim Nachweis von Primärantikörpern aus der Ziege kann das aufgrund der engen Verwandschaft von Ziege und Rind Probleme verursachen. Zum Nachweis von Ziege-Primärantikörpern ohne Kreuzreaktion mit Rind empfehlen wir Rind-anti-Ziege Antikörper von Jackson ImmunoResearch (805-xxx-180).

Sekundärantikörper aus Alpaka

Antikörper aus dem Alpaka

Antikörper aus dem Alpaka eignen sich ebenfalls als Sekundärantikörper, wenn Reagenzien bovine IgGs enthalten. Zudem befinden sich im Serum von Kameliden neben dem konventionellen IgG1 (klassischer Aufbau), IgG2 und IgG3. Diese besitzen weder leichte Ketten noch CH1 Domänen in den schweren Ketten (s. Abschnitt Sekundärantikörperstruktur). Die Schwere-Ketten-Antikörper haben eine geringe Größe, sind äußerst stabil und zeigen eine hohe Spezifität und Affinität zum jeweiligen Antigen. Diese Eigenschaften machen sie für den Einsatz als Sekundärantikörper besonders geeignet.
Immunpräzipitation mit Kaninchen Antikörpern

Sekundärantikörper aus Kaninchen

Immunpräzipitation mit Kaninchen Antikörpern

Sollen Antigen-Antikörper-Komplexe von anderen Komponenten mittels Protein A-Agarose getrennt werden, werden vorzugsweise Kaninchen-Antikörper eingesetzt. Diese binden besser an Protein A als Antikörper aus Ziege oder anderen Spezies. IgG aus Ziege, Schaf und Esel (aber auch aus Kaninchen) binden gut an Protein G.

Sekundärantikörper aus Huhn / Gallus

Sekundärantikörper aus Lama

Sekundärantikörper aus Maus

Sekundärantikörper aus Ratte

Sekundärantikörper aus Schaf

Sekundärantikörper aus Schwein

IgG-Gesamtmolekül

IgG-Gesamtmolekül

Das IgG-Gesamtmolekülist die am häufigsten verwendete Antikörperform und für die meisten Anwendungen am besten geeignet.

Durch Enzymatischen Verdau von IgG-Gesamtmolekülen (s. Abbildung) lassen sich Antikörper-Fragmente gewinnen, die über besondere Eigenschaften verfügen und sich deshalb in einigen Anwendungsbereichen besser als Nachweisreagenzien eignen als Gesamtmoleküle.

F(ab‘)2-Fragmente

F(ab‘)2-Fragmente

F(ab‘)2-Fragmente werden verwendet, wenn verhindert werden soll, dass der Sekundärantikörper an Fc-Rezeptoren auf Zelloberflächen bindet, um eine dadurch mögliche Hintergrundfärbung zu vermeiden. Sie haben bessere Diffusionseigenschaften, da sie kleiner als Gesamtmoleküle sind und können nicht über den Fc-Teil aggregieren. Beide Eigenschaften können für spezielle Anwendungen von Vorteil sein.

Der Einsatz von F(ab‘)2-Fragmenten verhindert nicht das Binden des Primärantikörpers an Fc-Rezeptoren! Das Blocken mit Normalserum, das aus derselben Wirtsspezies wie der Sekundärantikörper stammt, ist in diesem Fall nicht immer erfolgreich. Bei durch Fc-Rezeptoren verursachtem Hintergrund können Sie mit IgG oder IgG-Fragmenten der Spezies, aus der das untersuchte Material stammt, blockieren und mit einem gegen diese Spezies präadsorbierten Sekundärantikörper arbeiten.
Antiseren

Monovalente Fab-Fragmente

Monovalente Fab-Fragmente

Monovalente Fab-Fragmente werden zur Blockierung und Doppelmarkierung von Primärantikörpern aus derselben Spezies oder als Blockierungsreagenzien gegen endogene Immunglobuline in Zell- und Gewebefärbungen eingesetzt, bei denen Gewebe und Primärantikörper aus derselben Spezies stammen. Da Fab-Fragmente nur eine antigenbindende Stelle haben (monovalent), können diese, nachdem sie ihr Zielmolekül gebunden haben, keine weiteren Antikörper binden.

Beispielprotokoll: Blockieren endogener Immunglobuline mit einem monovalenten Fab-Fragment

Antiseren

Antiseren

Antiseren gegen IgG-Gesamtmoleküle (anti-IgG (H+L)) werden vor allem für den Einsatz als Brückenantikörper bei der PAP- und APAAP-Methode empfohlen.

Spezifität IgG(H+L)

Beispiel der Herstellung eines Antikörpers der Spezifität IgG (H+L) der Maus

Die Tierspezies (z.B. Ziege), in der das Antiserum gewonnen werden soll („Wirt“), wird mit aufgereinigtem Immunglobulin oder Immunglobulinteilen der entsprechenden Zielspezies immunisiert. In der Regel werden die Immunglobuline, die zur Immunisierung verwendet werden, aus Gesamtserum gewonnen, dh. die Zusammensetzung der einzelnen Subklassen und Teile entspricht der Normalverteilung im Serum der Spezies.

Antiserum von mit IgG(H+L) immunisierten Tieren enthält Antikörper, die sowohl gegen die leichte als auch gegen die schwere Kette des IgG-Moleküls gerichtet sind. Dieses Antiserum reagiert sowohl mit den F(ab‘)2-Anteilen als auch mit dem Fc-Anteil des IgG. Anti-IgG reagiert deshalb auch sehr gut mit anderen Immunglobulinklassen (IgM, IgA, IgE), da diese dieselben leichten Ketten (κ und λ) haben. Anti-IgG (H+L) Antikörper, die nicht präadsorbiert sind (siehe Schritt 6), besitzen ca. 40% – 60% Reaktivität mit leichten Ketten. Bei hoch adsorbierten anti-IgG (H+L) Antikörpern kann diese wesentlich geringer ausfallen. So bindet z.B. Katalog-Nr. 705-XXX-147 nur zu 9% – 30% an leichte Ketten.

Weitere Beispiele für Immunisierungen und die daraus resultierende Spezifität

Spezifität IgG(Fc)

IgG(Fc) Fragment

Die Immunisierung (z.B. der Ziege) mit aufgereinigtem IgG Fc-Fragment (z.B. aus Maus/Mensch) führt zu Antikörpern, die hochspezifisch die schwere Kette des IgG-Moleküls detektieren. Da die Unterschiede der verschiedenen Immunglobulinklassen im Bereich der schweren Kette liegen, lassen sich hier sehr gut IgG, nicht aber IgM, IgA und IgE nachweisen. Diese Fc-Fragment-spezifischen Antikörper werden zusätzlich gegen F(ab‘)2-Fragmente präadsorbiert. In einigen Fällen wird zudem eine mögliche Kreuzreaktion gegen IgM und IgA (anti-Human) oder nur gegen IgM (anti-Maus, anti-Ratte) durch weitere Präadsorption(en) minimiert. Diese Antikörper (anti-Human, anti-Maus, anti-Ratte) sind durch „Fcγ“ gekennzeichnet. Sie weisen weniger als 1% Restaktivität gegen leichte Ketten oder IgM bzw. IgA auf.

Spezifität IgM

 anti-IgM (µ-Kette), anti-IgM Fc5µ

Zur Herstellung von IgM-spezifischen Antikörpern wird die Wirtsspezies (z.B. Ziege) mit aufgereinigtem IgM (Maus und Ratte) oder Trypsin-verdautem, gereinigten IgM Fc5µ (Human) immunisiert. Nach affinitätschromatographischer Reinigung werden die anti-Maus und anti-Ratte IgM (µ-Kette)-spezifischen Antikörper gegen IgG adsorbiert. Die anti-Human IgM Fc5µ werden gegen IgG und IgA adsorbiert. Die anti-IgM-spezifischen Antikörper weisen in der Regel weniger als 1% Restaktivität gegen IgG oder leichte Ketten auf.
anti-IgA (a-Kette) / anti-IgE (e-Kette)

Spezifität IgE

Spezifität IgA

anti-IgA (a-Kette) / anti-IgE (e-Kette)

Antikörper reagieren mit der schweren Kette von IgA oder IgE und sind gegen andere Subklassen adsorbiert, so dass keine nennenswerten Kreuzreaktionen mit anderen Klasssen wie IgG oder IgM auftreten.

anti- IgG Subklassen aus Maus

Gleichzeitiger Nachweis von monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher Subklassen aus der gleichen Spezies.
Subklassenspezifische anti-Maus Antikörper gegen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c und IgG3

Diese Antikörper sollten aufgrund ihrer hohen Spezifität nur eingesetzt werden, wenn eine Unterscheidung von Maus-Subklassen erforderlich ist.

Für einen Nachweis der Maus IgG-Subklassen mit annähernd gleicher Sensitivität empfehlen wir den Ziege anti-Maus IgG (Subklassen 1, 2a, 2b und 3) Fcγ-Fragment-spezifischen Antikörper (Katalog-Nr. 115-XXX-164), der eine ausgeglichenere Reaktivität gegenüber diesen Subklassen besitzt.
Gleichmäßige Erkennung von Subklassen

anti-IgG F(ab‘)2-Fragment

anti-IgG F(ab‘)2-Fragment

Diese Antikörper werden durch Immunisierung mit aufgereinigtem F(ab‘)2-Fragment des Gesamt-IgG gewonnen. Da der Anteil an schwerer Kette des F(ab‘)2-Fragments nur sehr schwach immunogen wirkt, erhält man auf diese Weise Antikörper, die, abhängig vom Grad ihrer Präadsorption (siehe Schritt 6), zu mehr als 60% gegen die leichte Kette gerichtet sind. Anti-F(ab‘)2-Fragment Antikörper werden zusätzlich gegen IgG Fc-Fragment präadsorbiert und reagieren deshalb nur mit dem Fab-Teil des IgG.

Da das jeweilige Antiserum (z.B. aus der Ziege) überwiegend gegen leichte Ketten des κ-Typs gerichtet ist, ist die Sensitivität von anti-F(ab‘)2-Fragment Antikörpern bei der Erkennung von Primärantikörpern, die leichte Ketten vom λ-Typ tragen, eingeschränkt.

Mit diesen Immunreagenzien lassen sich alle lg-Klassen und Subklassen (IgM, IgG1-4, IgA, etc.) relativ gleichmäßig nachweisen. Diese Antikörper sind also optimal geeignet, wenn alle Ig-Klassen unabhängig von der Subklasse nachgewiesen werden sollen oder wenn nicht sicher ist, welcher Klasse der Primärantikörper angehört.

anti-IgG + IgM + IgA (H+L)

anti-IgG + IgM (H+L)

anti-IgG + IgM (H+L) / anti-IgG + IgM + IgA (H+L)

Um eine gleichmäßige Reaktivität zu erreichen, werden diese Produkte durch Mischen verschiedender Antikörper gegen die einzelnen Klassen hergestellt. In einer Mischung von anti-IgG + IgM (H+L) variiert die Reaktivität mit leichten Ketten von 30% bis 45%. Die anti-IgM-Gesamtreaktivität (einschließlich gegen leichte Ketten) in der Mischung liegt ca. zwischen 55% – 70%.
 

anti-Light Chain Antikörper

Nachweis von leichten Ketten

Anti-IgG leichte Kette-spezifische Antikörper reagieren mit nativen Primärantikörpern, die zur Detektion von Proteinen in Western Blots eingesetzt werden.

Bei geeigneter Verdünnung reagieren sie im Blot nicht mit der reduzierten und denaturierten schweren Kette (50 kDa) des IgG-Moleküls, zum Beispiel bei Proben die aus Immunpräzipitationsversuchen (IP) stammen, bei denen große Mengen der denaturierten schweren Kette das Zielprotein überdecken können.

Anti-Light Chain Antikörper haben eine starke Reaktivität mit nativen leichten IgG-Ketten, die Sensitivität bei reduzierten/denaturierten Formen kann aber veringert sein. Für eine sensitive / quantitative Detektion von leichten IgG-Ketten im Western Blot sind sie nicht geeignet.

Western Blot anti-Leichte Kette Antikörper

Western Blot Leichte Kette Antikörper

Nachweis von Maus IgG mit Anti-Maus IgG(H+L) (115-035-003) (A) und Anti-Maus Light-Chain-spezifischem Antikörper (115-035-174) (B). Der Leichte Kette Antikörper ermöglicht den Nachweis von Zielproteinen bei 50 kDa, die sonst überdeckt sind (Abb. Jackson ImmunoResearch)

Übersicht über empfohlene Sekundärantikörperverdünnungen 

Allgemeine Auswahlhilfe für Fluoreszenzfarbstoffen und -konjugate

Informationen zu Dylight-Sekundärantikörperkonjugaten der Firma ImmunoReagents

Brilliant Violet-Sekundärantikörperkonjugaten von Jackson ImmunoResearch
Enzymkonjugate

empfohlene HRP-Konjugate 

empfohlene Alk. Phos -Konjugate 

FAQ Horseradish Peroxidase (HRP) – Anwendung & Funktion.

Prinzipiell können Ig-spezifische Antikörper gegen eine bestimmte Spezies mit Immunglobulinen und Serumproteinen anderer Spezies mehr oder weniger stark kreuzreagieren. Deshalb werden Antikörper teilweise gegen Immunglobuline und Serumproteine einer oder mehrerer Fremdspezies präadsorbiert, wodurch eine Kreuzreaktivität mit Molekülen dieser Spezies weitgehend beseitigt wird (Kreuzreaktivität < 1%). Diese haben dann eine „minimierte Kreuzreaktivität“ (minimal cross-reaction to (MinX)) bzw. werden als adsorbiert gegen … bezeichnet.

Adsorbierte Antikörper werden empfohlen, wenn die mögliche Anwesenheit von Immunglobulinen einer anderen Spezies im Versuchsansatz zu Kreuzreaktionen führen kann.

Falls Antikörper mit unterschiedlichen Präadsorptionen zur Auswahl stehen, sollte berücksichtigt werden, dass Antikörper, die gegen nahe verwandte Spezies adsorbiert wurden, z.T. eine stark reduzierte Epitoperkennung aufweisen und deshalb einige monoklonale Antikörper nur noch schwach erkennen. Dies gilt insbesondere für anti-Maus IgG (adsorbiert gegen Ratte), anti-Ratte IgG (adsorbiert gegen Maus) oder anti-(arm.)Hamster IgG (adsorbiert gegen Maus, Ratte).

Gegen eng verwandte Spezies präadsorbierte Antikörper reagieren möglicherweise mit einigen IgG-Subklassen (v. a. IgG2b, IgG2c und IgG3) nicht gut. Dies gilt besonders für die Subklassen, die weitestgehend homolog mit der Spezies sind, gegen die präadsorbiert wurde. So sollte beispielsweise anti-Maus IgG, das gegen Ratten-IgG präadsorbiert wurde, nur eingesetzt werden, wenn ein Primärantikörper aus der Maus a) in Rattengewebe, welches Ratten-Immunglobuline enthält, oder b) in anderen Geweben zusätzlich zu einem Primärantikörper aus der Ratte nachgewiesen werden soll.

Rinderserumalbumin (BSA) und Trockenmilch aus Rind enthalten meist Verunreinigungen boviner Immunglobuline, welche mit anti-Rind, anti-Ziege, anti-Pferd und anti-Schaf IgG Antikörpern reagieren. Daher kann die Verwendung von BSA und/oder Trockenmilch zur Blockierung oder Verdünnung dieser Sekundärantikörper die Hintergrundfärbung signifikant erhöhen oder den Antikörpertiter reduzieren. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich die Verwendung von speziell IgG-freiem BSA von Jackson ImmunoResearch (z.B. Katalog-Nr. 001-000-161). Um eine Kreuzreaktivität mit Milchpulver, BSA oder FCS zu verhindern, empfehlen wir zum Nachweis von Ziege-Primärantikörpern Sekundärantikörper aus dem Rind (805-xxx-180).